胎牛血清是高品质的,目前用于组织培养的血清主要是牛血清

  1. 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 5.
    对培养中的细胞起到某些保护作用:有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,硒等。

永利皇宫 1

IMDM细胞培养基IMDM是由Iscove’s改良的Eagle培养基,增加了几种氨基酸和胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培养,以及无血清培养的基础培养基。
RPMI-1640细胞培养基Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial
Institute研制,针对淋巴细胞培养设计,BSS+21种氨基酸+维生素11种等,广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞,也用做悬浮细胞培养。
Fischer’s细胞培养基用于白血病微粒细胞培养。HamF10、F12细胞培养基1963年、1969年由Ham设计,含微量元素,可在血清含量低时用,适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞,F12适用于CHO细胞。DMEM/F12细胞培养基DMEM和F12细胞培养基按照1:1比例混合效果最佳,营养成分丰富,且可以使用较少血清,或作为无血清培养基的基础培养基。1.低血清细胞培养基血清对于在传统培养基配方中生长和增殖的大多数细胞系来说是必不可少的。大部分的组织培养研究者非常熟悉血清添加物给予基本培养基配方的良好生长支持特征。然而,伴随血清的使用也带来了很多的问题。
费用因素生产血清费用高而效率低。小牛血清还必须来源于没有疯牛病、口蹄疫和其它高度传染性疾病的地区。
差异所有的血清都是一种成分不确定的混合物,血清批与批之间的组分存在差异。
传染源动物血清有可能携带传染源,包括支原体、病毒和有毒物质。任何一种传染源可能对正在生长的细胞系或者制品带来风险。
法规问题为了使与传染源相关的风险减少到最低,存在多个国家间进出口生物材料的国际法规。为了解决这些问题,清大天一公司开发了多种营养培养基,以最小化和消除与使用动物血清相关的制品安全性问题。
低血清细胞培养基的原理通常在用传统培养基培养细胞时须加入约10%的小牛血清,低血清培养基是在基础培养基中添加了额外的营养成分,使小牛血清的添加量减少50%到70%,而对于细胞生长、增殖、形态和功能有较小或者没有影响。
低血清培养基的优点
小牛血清是细胞培养液成本最大的原料,使用低血清培养基明显地节省培养液成本。
减少制品纯化损失,提高纯化收率,便于分离纯化。
减少由于不确定蛋白或者其它血清组分带来干扰和差异的风险。
提高制品安全性。 批间差减少或影响降低:a)血清用量减少可以减少使用批次。b
血清用量减少使得批间差的影响减少。
细胞在低血清培养基的生长相当或者优于加入10%小牛血清的传统培养基,没有观察到在细胞形态及增殖方面的显著差异。
低血清细胞培养基的应用
VERO细胞、BHK21细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中的培养。1.无血清无动物组分细胞培养基无血清无动物组分细胞培养基意指以该培养基配制的培养液无须添加牛血清即可培养细胞和维持生长收液,且该培养基成分中不含有任何动物来源成分。在细胞培养生产生物制品过程中无须添加动物来源成分,避免疯牛病、口蹄疫等传播进入人体,减少人、兽在使用生物制品时的特异性免疫反应、降低产品成本(如降低培养液成本,简化下游纯化工作及提高产品收获量等)。采用生物反应器、无血清无动物来源成分培养基进行细胞培养制药是21世纪生物制药发展趋势;美国
FDA和美国农业部已经严格控制在细胞培养中胎牛血清的使用。同时,高密度细胞培养并长时间维持细胞密度是高表达率和高产量的关键,只能通过无血清悬浮培养技术来实现。为了获得足够的营养成分,无血清无动物组分细胞培养基中氨基酸含量倍增,另外添加了生长因子和/或细胞因子,以及含有个别蛋白或大量蛋白的组分。无血清无动物组分细胞培养基通常是特定细胞专用培养基,如无血清无动物组分CHO悬浮细胞培养基适用于CHO悬浮细胞。2.替代天然培养基培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分,所有的成分均有已知的化学结构。细菌培养基细菌培养基为肺炎、流脑等细菌培养疫苗生产专用培养基。用于细菌性疫苗大规模生产中细菌体的培养及实验室中细菌体的研究培养。目前细菌性疫苗生产厂家及实验室都使用自行配制的培养基进行细菌体的繁殖培养,由于配制工艺的不同、各种培养基组分来源不同,以及培养基中重要活性添加剂来源的质量不稳定性,导致了细菌体繁殖培养的数量和质量不稳定,批间差较大,结果时好时坏,该结果不仅给培养基使用者增加了成本,还严重影响了疫苗生产厂家的产量和质量,延误科研进程。

天然细胞培养基
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。血清种类
目前用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因:来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。
血清的主要成分
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。血清主要作用1.
提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。2.
提供激素和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。3.
提供结合蛋白:结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

血清被广泛应用于细胞培养达几十年之久。动物血清主要包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清等,其中以胎牛血清的使用最为普遍。

永利皇宫,六、细胞培养基的基本要求 1.营养成分
氨基酸、单糖、维生素、无机离子与微量元素。 2.促生长因子及激素 3.渗透压
4.pH 5.无毒、无污染 七、细胞培养基组成及作用 1.氨基酸
组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。
必需氨基酸包括L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等。
2.维生素
维持细胞生长的生物活性物质,在细胞代谢中起调节及控制作用。在细胞培养中,尽管血清是维生素重要来源,但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。脂溶性维生素如:A、D、E、K。水溶性维生素如:B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸、生物素、C、烟酰胺等。
许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分,没有它们,酶便没有活性,代谢活动将无法进行。
VA是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体,对上皮细胞有重要的维护作用。VD参与调节钙的吸收。VE是抗氧剂,可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪酸被氧化。VK缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长。
叶酸是合成四氢叶酸的重要原料,四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用。
生物素是一些特异羧化酶的组成部分,参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。
3.碳水化合物
碳水化合物是细胞生长主要能量来源,其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
4.无机离子
钠、钾、镁、钙、磷等基本的无机离子,这些都是细胞组成所必须并参与细胞的代谢。
培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外,通过提供钠,钾和钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素,细胞通常可耐受260mOsm/kg−320mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别是溶于强酸或强碱中的物质。
Na+是细胞外液中最主要的阳离子,对维持渗透压的恒定有决定性的作用。K+主要分布在细胞内液,细胞内K+的对于激活某些酶是必需的,它在调节细胞内环境的酸碱平衡也有极重要意义。Ca2+在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着,在细胞内参与许多重要的细胞生理活动,如传导、参与肌肉细胞收缩等。Mg2+是构成细胞间质的重要成分,对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控的功用是十分广泛而不可缺少。

核心提示:天然细胞培养基
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养

动物血清在细胞培养中提供细胞增殖所需的生长因子、激素、转移蛋白、贴壁和铺展在培养基质上的因子、蛋白酶抑制剂和其他营养物质。使用血清的优点是血清含有促进细胞增殖和维持的大部分因子,它几乎是通用的生长添加物,适用于动物、人和昆虫细胞等的细胞培养。因而使用血清不需要为每一个细胞系优化培养基,节省了大量时间和精力。

培养基

DMEM细胞培养基

DMEM细胞培养基

30次收液中平均HBsA含量

3.75μg/ml

3.51μg/ml

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胎牛血清是高品质的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。但是由于国内外血清质量良莠不齐,所以,想要保护娇嫩细胞,选对血清很关键哦!

6.86

Ausbian血清精选内毒素极低,产量大于1600瓶(500毫升)的血清批次,满足干细胞、基因敲除、原代培养、细胞典藏、长期传代等各类细胞的培养要求;完整的检测报告,及灭病毒服务,为各类临床相关项目的申报提供完整支持。2014年,Ausbian血清商标已在中国商标局注册,目前此商标属上海威正翔禹生物科技有限公司独家所有。Ausbian血清目前在中国市场主要为澳洲血源的产品,广泛应用于中科院、医科院、军科院、细胞库、北大、清华、复旦、浙大等科研院所及大学的重点细胞实验。

细胞培养技术对生物制品成本的影响 1.表达量提高
通过细胞培养技术的不断改进可以充分利用现有设备,大幅度提高生物制品表达量,降低生物制品的单位制造成本;同时,由于产量提高并不新增固定资产投资,也带来生物制品的单位固定成本的降低。
因此提高表达量可以有效降低生物制品的单位成本,既降低变动成本,也降低固定成本,使得制品利润率提高,市场竞争能力增强。
2.培养液成本降低
在很多使用牛血清的细胞培养液中,为牛血清支付的成本远远高于培养液中的细胞培养基等其它成分,因此通过采用低血清细胞培养基,降低牛血清用量,可以降低细胞培养液总成本。
3.纯化成本低,制品安全性提高
牛血清的使用量不仅增加了细胞培养液的成本,更严重的是带来动物来源成分、杂蛋白,以及不安全因素,这些成分越多,纯化的成本越高、生物制品原液损失越大,生物制品的成本越大。因此采用低血清、无血清培养细胞可以有效降低纯化成本何损失,提高生物制品成品率和利润率。
4.综合成本降低
综上所述,动物细胞培养技术是生物制品产业化的核心技术之一,在生产中,应该系统、全面的研究细胞培养技术对生物制品成本的综合影响,不断追求最佳的细胞培养技术,提高生产效率,有效降低生物制品成本,提高利润率,增强产品市场竞争力。

一、培养基的历史
体外培养(invitroculture)包括:组织培养(tissueculture)、细胞培养(cellculture)、器官培养(organculture)。顾名思义,就是将活体结构成分(如活体组织、活体细胞或者活体器官等)从体内或其寄生体内取出,放在类似于体内生存环境的体外环境中,让其生长发育的方法。广义组织培养与体外培养同义。
体外培养已经历了约一百年的发展历史,但发展初期进程比较缓慢,没有引起很多学者的重视。直到上世纪50年代后期,体外培养技术才广泛应用于生物学研究的各个领域,使这项技术得到飞速发展。现在体外培养已成为细胞工程、基因工程、抗体工程的重要组成部分。
细胞培养指从生物机体取出部分组织分散成单个细胞或直接从机体取出单个细胞,也可把体外培养细胞分散成单个细胞在体外条件下培养,细胞能继续存活与增殖。培养过程中细胞不再形成组织。
发展与完善细胞培养技术围绕防止污染、改进培养方法、设计新型培养容器、设计不同的培养液等几个方面进行。
1885年Roux温生理盐水培育鸡胚组织;
1903年Jolly,1906年Beebe等发明了盖片悬滴培养;
1907年Harrison培养蛙胚神经成功,开始创建盖片凹玻璃悬滴培养法;
1910、1912年Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代,完善了悬滴培养法;
1924年Maximow采用双盖片悬滴培养法;
1923年Carral设计创立了卡氏瓶培养法,用此法可根据需要随时更换培养液,既有利于组织不断生长,又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞,极大地推动了当时组织培养研究。
Earle等加以改进,使大量细胞能直接生长于玻璃瓶壁上,培养了正常细胞与肿瘤细胞的细胞株。至此大多数研究人员都采用培养瓶培养细胞。
组织培养从二十世纪40年代起迅速发展,在培养容器、培养基和培养技术等方面出现了很多革新。
在培养容器方面,由简单的用试管、旋转管培养,发展到多种培养瓶培养,近年来,塑料瓶、皿、多孔培养板的使用已日趋普遍。
在培养基方面,从50年代初,Parke、Eagle等设计出合成培养基后,从纯天然培养基到合成培养基、从鸡胚浸出液发展到动物血清,直至60年代设计出无血清培养基。
首先反映在设计不同种类的缓冲盐溶液,以用来培养不同的细胞和洗涤细胞。Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液,Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。
在培养技术方法方面,革新进展更为迅猛,Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法,首建长期传代的L-细胞系。
1948年Sanford创建单细胞分离培养法,获L-细胞纯系。
1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
1961年Hayflick首建人二倍体细胞系25种,开辟了应用新方向。
从50年代末开始,组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段,广泛应用于生物学和医学研究各个领域。
诱变建立遗传缺陷细胞株、杂交瘤技术制备单抗、发展细胞大量培养技术、利用重组技术构建工程细胞株,已成为生物工程的重要生产手段。
在连续灌注培养工艺方面,美国Ohashi,Ryo等人2001年报道采用2L一次性生物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体,以BectonDickensonCellMab+10%胎牛血清+1%聚醚F-68为培养基,最高活细胞密度超过1×107cells/ml;2001年瑞士Heine,Holger等人用带超声细胞分离器的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠杂交瘤细胞生产单克隆抗体,稳态培养时活细胞密度超过2×107cells/ml;2004年德国Thomas等人在1L搅拌罐生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1糖蛋白,采取葡萄糖浓度限制的高产率灌注工艺减少有害代谢物,代谢转向TCA循环增加,活细胞密度保持在×107cells/ml。
在流加悬浮培养工艺方面,美国麻省理工XieLiangzhi等人2000年报道在2L生物反应器中流加培养杂交瘤细胞,通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率,补充培养基包括营养成分、胎牛血清和痕量金属,最大活细胞密度达到1.7×107cells/mL。(生物秀实验频道
www.bbioo.com)

24小时

瓶壁铺满85%,良好,状态饱满

五、细胞生存条件 1.基本营养物质 糖
六碳糖主要能源、维持渗透压,含葡萄糖1-5%。 氨基酸
维持生存需12种氨基酸(精、胱、亮、异亮、赖、蛋、苯丙、苏、色、组、酪、缬)。谷氨酰胺需量最大,缺乏时细胞生长不良。
单细胞培养或细胞量少时,所需氨基酸的种类和量增多,细胞主要利用左旋氨基酸异构体。
维生素
细胞大部分需水溶性B族维生素,Vitc不可少,1-10mg/100ml可促进正常细胞生长繁殖。
2.促生长因子、激素类物质 3.其它物质 基本元素、微量元素、促细胞贴附物质
4.水 主要成分和生存环境,要求高纯度水。 5.温度
哺乳动物及人源细胞最适培养温度为35℃—37℃,对低温耐受力比高温强。39℃以上受损→死亡;不低于0℃时,细胞能生存,但代谢降低、分裂延缓。
6.气体环境和pH 需O2、CO2,通氧量过大对细胞有毒害。
CO2主要与维持pH有关,细胞培养最佳pH为7.2—7.4,通过缓冲系统和调节CO2含量,维持正常pH。
开放培养要求5%CO2环境、HEPES10—50mmol/ml可防止pH变化。
含Earle’s缓冲系统的培养基适合于5%CO2的培养条件,Hanks’缓冲系统的培养基仅含有0.35g/LNaHCO3,不能用于5%CO2的环境,若放入CO2培养箱,溶液将迅速变酸,使用时应注意。
7.湿度和光
开放培养相对湿度控制在95%。细胞培养需避光,紫外线或可见光可造成核黄素、酪氨酸、色氨酸等产生有毒的光产物,抑制细胞生长,降低其贴壁能力。
8.影响细胞生长的其它因素
接触橡胶用品、收集细胞时离心速度过大、细胞接种浓度过低等。

二次苗滴度

199培养基

培养基

199培养基

199培养基

平均效力

4.24

3.49

瓶壁铺满98%以上,细胞连接紧密,状态饱满

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